1．(2019·四川绵阳诊断)基因工程的应用十分广泛，利用此项技术可创造出更加符合人类需求的优良品种或产品。如美洲拟鲽(是鲽科下的一种比目鱼)的体液中存在抗冻蛋白，能够降低鱼的血液冰点。科学家按cDNA路线分离和克隆了抗冻蛋白基因，并将其导入番茄，获得了抗冻的番茄品种。根据有关知识，回答下列问题：
(1)基因工程操作的核心步骤为____________，以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是_______________________________________。
(2)将目的基因导入植物细胞最常用的方法是______________。
(3)构建重组质粒，需要限制性核酸内切酶切取目的基因、切割质粒。限制性核酸内切酶Ⅰ的识别序列和切割位点是—C↓GATCC—，限制性核酸内切酶Ⅱ的识别序列和切割位点是—↓GATC—。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的末端能否连接？________。理由是______________________________。
(4)质粒作为基因工程常用运载体必须具备的条件是_________________(至少答2点)。
解析：(1)以mRNA为材料获得cDNA，其实质是逆转录过程。(2)目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法等。其中最常用的是农杆菌转化法。(3)分析可知，限制性核酸内切酶Ⅰ和限制性核酸内切酶Ⅱ切割形成的末端相同，故在DNA连接酶的作用下，这两种限制酶切割后形成的末端能连接。(4)作为基因工程的运载体，必须有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上；必须具备自我复制的能力，或可以整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制；必须带有标记基因，以便进行重组后的筛选等。
答案：(1)基因表达载体的构建 在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA
(2)农杆菌转化法
(3)可以 因为由两种不同限制酶切割后形成的黏性(或平)末端相同
(4)能在宿主细胞内复制并稳定保存；具有多个限制酶切位点有利于剪切；具有标记基因有利于检测等
